Noua formulă lipozomală de Vitamina C: proprietăți și biodisponibilitate - Partea I

Postat de: Cosmin 04.07.2019 0 Comentariu
 

 

 Jurnalul de Cercetări în Domeniul Lipozomilor

 

Noua formulă lipozomală de Vitamina C: 

 

proprietăți și biodisponibilitate (Partea I)

 
Rezumat
Vitamina C este un compus exogen necesar pentru o varietate de procese metabolice, astfel încât asigurarea eficientă a acestei vitamine este vitală pentru menținerea homeostazei corpului.
 
Farmacocinetica Vitaminei C și cantitățile reduse de vitamina C din alimentele procesate necesită suplimentarea sa continuă.
 
În această lucrare, prezentăm noua formulă lipozomală de vitamina C care nu conține niciun solvent organic nociv. Formula a fost caracterizată cantitativ cu privire la compoziția sa chimică și la nanostructurarea sa.
 
Accesibilitatea vitaminei C din formulă pentru celule a fost evaluată prin utilizarea dovezilor derivate din experimentele efectuate asupra culturilor celulare. În final, biodisponibilitatea sporită a vitaminei C din formulă a fost demonstrată în cadrul unui experiment medical. 
 
1. Introducere
 
Vitamina C este un compus esențial pentru menținerea homeostazei celulare la mamifere.
Totuși, reglările endogene ale vitaminei C la oameni nu sunt posibile din cauza unei mutații care i-a eliminat disponibilitatea endogenă. În consecință, această vitamină trebuie obținută din alimentație. Lipsa feedback-ului direct între cerințele corpului și asigurarea intrinsecă a acidului ascorbic determină ca o parte mare a populației să aibă diferite niveluri de deficiențe permanente sau temporare (Padayatty and Levine, 2016) (Padayatty et al., 2004) (Lindblad, Tveden-Nyborg and Lykkesfeldt, 2013). Deoarece vitamina C este implicată direct în multe procese vitale, cum ar fi protecția împotriva excesului de specii reactive de oxigen, menținerea homeostazei fierului și controlul expresiei genice, chiar și deficiența moderată poate avea consecințe grave asupra sănătății (Fraga and Oteiza, 2002) (Salganik, 2001) (Lane and Richardson, 2014) (Babaev et al., 2010) (Young, Zuchner and Wang, 2015) (Finck et al., 2014). Această problemă poate fi prevenită cu ușurință printr-o ajustare a alimentației și/sau prin suplimentarea acesteia. Suplimentarea este sigură deoarece rinichii îndepărtează orice exces de vitamina C, împiedicând supradoza. Doza zilnică recomandată de vitamina C pentru o persoană sănătoasă a fost determinată ca fiind 500 mg/zi (Harrison, Bowman and Polidori, 2014) (Paschalis et al., 2016) (Savini et al., 2005).
 
Recomandarea nu ia în considerare cerințele sporite din timpul activităților solicitante la nivel fizic sau psihologic (May and Qu, 2005) (Nair, Song and Oh, 2016).
De exemplu, a fost demonstrat că este benefică sporirea cantității de vitamina C pe durata terapiilor oncologice (Du, Cullen and Buettner, 2012) (Fritz et al., 2014), în timpul tratării afecțiunilor de piele (Kishimoto et al., 2013) (May and Qu, 2005) (Stamford, 2012), pentru reducerea efectelor accidentelor vascular-cerebrale (Spector, 2016) sau în scopul eliminării anumitor tulburări ale sistemului digestiv (Aditi and Graham, 2012).
Asigurarea vitaminei C prin utilizarea rutei orale necesită reducerea ratei degradării sale în intestine și facilitarea absorbției sale. De obicei, vitamina C este administrată oral, în formă cristalină sau ca soluție, ceea ce o face susceptibilă degradării în tractul gastrointestinal, mai ales în prezența ionilor de metale (Michels and Frei, 2013).
Degradarea vitaminei C poate fi redusă în mod eficient prin asocierea sa cu interfața hidrofilic-hidrofobică, aceasta putând fi asigurată de agregatele lipidice (Pastoriza-Gallego, Losada-Barreiro and Bravo-Diaz, 2012) (Wechtersbach, Ulrih and Cigic, 2012) (Nagle and Tristram-Nagle, 2000).
 
Agregatele lipidice, cum ar fi lipozomii, sunt adecvate pentru acest scop. Reduc degradarea vitaminei C în tractul gastrointestinal, încetinind-i eliberarea și sporindu-i absorbția (Wechtersbach, Ulrih and Cigic, 2012) (Hickey, Roberts and Miller, 2008). Lipozomii atenuează și posibilele perturbări ale funcționării tractului gastrointestinal, ceea ce permite administrarea dozelor sporite de vitamina C pentru perioade de timp extinse.
 
Suplimentar, nu trebuie ignorat faptul că lipidele, mai ales fosfatidilcolinele, reprezintă o componentă importantă a unei alimentații echilibrate cu efecte pozitive documentate asupra stării de bine generale a pacienților (Alvarez and Rodriguez, 2000) (Blesso, 2015) (Garcia and Aguero, 2015) (Keller, 2001) (Kullenberg et al., 2012) (van der Veen et al., 2017).
Toate aceste elemente au stimulat apariția unui număr mare de lucrări care au condus la dezvoltarea formulelor lipozomale de vitamina C pentru o varietate de aplicații (Hickey, Roberts and Miller, 2008) (Xie and Ji, 2008) (Marsanasco et al., 2011). Producerea preparatelor lipozomale la scară industrială necesită controlul strict al proceselor cu privire la parametrii chimici și fizico-chimici, ceea ce face producția acestora foarte dificilă (van Nieuwenhuyzen and Szuhaj, 1998) (van Nieuwenhuyzen and Tomas, 2008). Este vital nu doar să se asigure compoziția adecvată și stabilă, din punct de vedere chimic, a preparatului, dar și structurarea sa la scală nano. Aceasta semnifică că analiza preparatelor lipozomale necesită utilizarea metodelor de cuantificare avansat, cum ar fi Cromatografia Lichidă de Performanță Înaltă (HPLC), Dispersia Dinamică a Luminii și
Criomicroscopie Electronică de Transmisie.
 
Provocarea suplimentară este reprezentată de eliminarea solvenților organici din formulă și preferabil, și din procesul de producție. În lucrare, prezentăm noua formulă lipozomală a populației uniforme de vezicule lipidice, fără utilizarea niciunui solvent organic indezirabil, cu stabilitate pe termen lung. Noua formulă dezvoltată sporește în mod semnificativ biodisponibilitatea vitaminei C și îi menține eficacitatea la nivel celular. 
 
 
2. Materiale și metode
 
2.1 Materiale
Fosfatidilcolină de soia (Fosfolipon 90G) a fost achiziționată de la Lipoid GmbH (Ludwigshafen, Germania), iar lecitina de rapiță de la Somar (Polonia). Ascorbatul de sodiu a fost de tip farmaceutic și a fost obținut de la Brenntag (Polonia), iar glicerina de la TechlandLab (Tarnobrzeg, Polonia). Apa din toate soluțiile a fost înalt purificată, cu o conductivitate de 0,056 uS/cm – aproximativ 17,86 MΩ (AquaEngineering, Polonia). Formiatul de amoniu și solvenții organici, cum ar fi n-hexan, 2-propanol și acetonitril au fost de tipul HPLC și au fost achiziționați de la VWR International (Radnor, SUA). 
 
2.2 Prepararea formulei lipozomale
Formula lipozomală de vitamina C a fost pregătită prin utilizarea glicerinei acceptate în domeniul farmaceutic, ca solvent pentru lipide. Cealaltă caracteristică unică a formulei este conținutul mare de lipide, adică peste 20% w/w. Conținutul mare de lipide conduce la o eficiență superioară a încapsulării. 
Lipozomii au fost formulați prin amestecarea a doi solvenți: glicerină, care conține lipide (1:1 w/w) și soluția apoasă, care conține ascorbat de sodiu, cu concentrație API egală 20% w/w. Populația  uniformă de lipozomi a fost formulată spontan, urmând amestecării. Conținutul mare de lipide (peste 20%) din amestec conduce la o faza apoasă structurată, caracterizată de o viscozitate superioară și o consistență similară gelului. Pentru studiile de control, soluția apoasă de ascorbat de sodiu a fost schimbată cu apa pură. Lipozomii pentru validarea metodei HPLC au fost pregătiți prin hidratarea cu formiatul de amoniu 20 mM, pH 3,2 și 33,3% (w/w) din ascorbatul de sodiu.  După fiecare preparare a suspensiei lipozomale, greutatea și polidisperitatea au fost măsurate pentru confirmarea creări unei populații lipozomale monodisperse.
 
2.3 Pregătirea eșantioanelor pentru analiza HPLC
Componentele hidrofobice și hidrofilice ale formulei au fost separate prin metoda Bligh-Dyer (Bligh and Dyer, 1959), cu anumite modificări esențiale. Volumul fazei apoase a fost crescut foarte mult pentru a împiedica cristalizarea acidului ascorbic indusă de metanol. În mod specific, eșantionul și metanolul au fost amestecate într-un raport al volumului 1:1. Două volume de cloroform au fost adăugate și eșantionul a fost scuturat cu putere. Ulterior, eșantionul a fost diluat de 19 ori în soluție tampon de formiatul de amoniu 20 mM (pH 3,2) și amestecat din nou. În final, eșantionul a fost centrifugat la 2500 RPM timp de 10 minute pentru a grăbi separarea fazelor. Faza apoasă superioară cu vitamina C a fost extrasă pentru măsurare. Cu ajutorul acestui protocol, recuperarea metodei a fost de peste 90%, ceea ce a fost stabilit într-un experiment separat. 
 
2.4 Analiza HPLC
Analizele HPLC au fost efectuate cu sistemul Knauer (Knauer GmbH, Germania) alcătuit din pompe Knauer Azura, cap ceramic P2.1, Dispozitiv Autoeșantionare Optimas cu 96 poziții și termostat Knauer Azura CT2.1. Toți reactivii au fost filtrați printr-un filtru cu dimensiunea ochilor 220 nm și degazificați anterior măsurării.
 
2.4.1 Determinarea concentrației de vitamina C din lipozomi 
Conținutul de vitamina C din lipozomi a fost determinat prin metoda HPLC dotată cu un detector UV-VIS Knauer Azura UVD2.1S. A fost utilizată o coloană Knauer LiChrospher 100-5 Diol (125 x 4 mm2) pentru a separa compusul de alți compuși. Temperatura coloanei a fost setată la 20°C. Faza mobilă a fost alcătuită dintr-o soluție 10% (v/v) de formiat de amoniul 20 mM acidificat cu acid formic până la pH 3,2 și 90% (v/v) acetonitril. Debitul pe durata analizei a fost 1 ml/min. Eșantioanele standard pentru curbele de calibrare au fost pregătite prin dizolvarea cantității adecvate de ascorbat de sodiu în soluție tampon de formiat de amoniu 20 mM (pH 3.2).
 
2.4.2 Determinarea concentrației de lipide în lipozomi
Analiza conținutului de fosfatidilcolină a fost efectuată prin cromatografie lichidă de performanță înaltă dotată cu detector de lumină dispersată cu evaporare (HPLC-ELSD) (W Letter, 1992) și s-a desfășurat pe baza metodei L-M-HPLC-SPC-3E/01 asigurată de Lipoid GmbH (Ludwigshafen, Germania) (Lipoid GmBH, 2006). Metoda utilizează coloana Knauer LiChrospher 100-5 Diol (125 x 4 mm2) iar măsurarea a fost efectuată prin utilizarea unui gradient de fază hidrofobică a n=--hexan-izopropanol în faza apoasă care conține acid acetic și trietilamină. 
Metoda a fost ajustată pentru detectorul ELSD Alltech 3300 (Buchi, Elveția), ceea ce a îmbunătățit calitatea semnalului. Această modificare a implicat eliminarea modificatorilor de fază, adică acid acetic și trietilamină. Modificările nu au afectat parametrii semnalelor înregistrate, astfel încât lărgimea completă la jumătate înălțime (FWHM) a fost 0,1020 ± 0,0034 (deviația standard relativă (RSD) = 3,3%) și înălțimea semnalului măsurat a fost egală cu 352 ± 14 (RSD = 4,1%). Măsurarea a fost efectuată într-un gradient de fază mobilă alcătuit din două componente. Faza A este alcătuită din n-hexan și 2-propanol amestecate într-un raport al volumului de 830:170 și faza B este alcătuit din 2-propanol și apă amestecate într-un raport al volumului de 340:55.3. Compozițiile fazei mobile sunt indicate în Tabelul S1 cu date suplimentare.
 
2.5 Distribuția dimensiunii lipozomilor și determinarea potențialului zeta 
Tehnica dispersiei dinamice a luminii (DLS) permite măsurarea potențialului zeta și a distribuției dimensiunii agregatelor în suspensia apoasă. Pentru acest scop, eșantioanele de vitamina C lipozomală cu concentrație înaltă au fost diluate de 60 de ori cu soluție izosomatică anterior efectuării analizei.
Măsurarea a fost efectuată în cuve de polistiren de 1 cm. Măsurătorile dimensiunii a fost efectuate prin utilizarea dispozitivului ZetaSizer Nano ZS (Malvern, England).
 
2.6 Determinarea eficiențe încapsulării vitaminei C 
Eficiența încapsulării (%EE) vitaminei C în lipozomi a fost determinată prin utilizarea ultrafiltrării prin membrane cu masă critică 50 kDa (SpectrumLabs, SUA) urmată de determinarea conținutului de vitamina C în permeat prin HPLC UV-VIS. Stabilitatea lipozomilor pe durata ultrafiltrării a fost controlată cu ajutorul măsurătorilor DLS. Eficiența încapsulării vitaminei C a fost calculată prin utilizarea formulei 
EEvitC = (1-mfree/mtotal) x 100,
acolo unde mfree este masa vitaminei C din permeat și mtotal este masa totală a vitaminei C din eșantion.
 
2.7 Obținerea imaginilor de Microscopie Crio-Electronică de Transmisie prin Criogenie
Imaginile de microscopie Crio-Electronică de Transmisie (cryo-TEM) au fost obținute prin utilizarea unui microscop Tecnai F20 TWIN (FEI Company, SUA) dotat cu un tun de emisie câmp, care funcționează la o tensiune de accelerare de 200 kV. Imaginile au fost înregistrate pe o cameră Eagle 4k HS (FEI Company, SUA) și procesate cu ajutorul software-ului TIA (FEI Company, SUA). Specimenul a fost preparat prin verificarea soluțiilor apoase pe rețele cu un film de carbon perforat (Quantifoil R 2/2; Quantifoil Micro Tools GmbH, Germania). Anterior utilizării, rețelele au fost activate timp de 15 secunde în plasma de oxigen prin utilizarea unui dispozitiv de curățare plasmă Femto (Diener Electronic, Germania). Eșantioanele crio au fost preparate prin aplicarea unei picături (3 μL) de soluție pe rețea, uscare prin tamponare cu hârtie de filtru și congelare rapidă în etan lichid prin utilizarea unui dispozitiv complet automat de uscare prin tamponare Vitrobot Mark IV (FEI Company, SUA). După pregătire, specimenele vitrificate au fost păstrate în nitrogen lichid până la introducerea într-un recipient crio-TEM Gatan 626 (Gatan Inc., SUA) și analizate în TEM la o temperatură de -178 °C.
 
2.8 Studii reologice
Caracteristica reologică a formulei lipozomale noi a fost măsurată prin utilizarea reometrului Brookfield DV2T de tip con-placă, cu tipul conului CPA-51Z. Temperatura din camera de măsurare a fost setată cu termostatul la 25°C, cu ajutorul băii de apă circulate (VWR).
 
2.9 Studii comparative ale citotoxicității celulare a vitaminei C lipozomale spre deosebire de vitamina C liberă 
Experimentele au fost efectuate asupra a două linii celulare din cancer mamar, SKBR3, MCF7 și linia celulară sănătoasă BJ, ca linie de control. Toate culturile celulare au fost achiziționate de la Colecția Culturilor Tip Americane (Manassas, SUA). Supraviețuirea celulelor în prezența concentrațiilor sporite de ascorbat de sodiu (0,4mM - 5mM) în forma liberă și lipozomală a fost determinată cu ajutorul protocoalelor descrise în alte lucrări (Karlsen, Blomhoff and Gundersen, 2005). Pe scurt, au fost realizate culturi de celule în medii care conțineau 10% FBS, obținute de la Thermo Fisher Scientific (Waltham, SUA), la o temperatură de 37°C, sub 5% CO2. Ascorbatul de sodiu și formula lipozomală a ascorbatului de sodiu au fost diluate în mediul de cultură anterior adăugării la celule. Culturile de celule au fost menținute prin utilizarea următorilor reactivi: mediu RPMI, mediu DMEM, penicilină, streptomicină, L-Glutamine 200Mm, 0,25% Tripsin-EDTA achiziționat de la Thermo Fisher Scientific (Waltham, SUA) și PBS CaMg achiziționat de la Corning (Corning, SUA).
Supraviețuirea celulelor a fost determinată cu testul MTT efectuat pe baza ISO EN ISO 10993-5. bromură de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil) tetrazoliu (MTT) a fost achiziționat de la Sigma Aldrich (Saint Louis, SUA). Culturile de celule au crescut pe plăci cu 96 de cavități, timp de 48 de ore, iar apoi a fost adăugat ascorbatul de sodiu (concentrația finală s-a încadrat în gama 0,4 mM - 5 mM). După o oră de incubație, mediul a fost retras și culturii i s-a adăugat 100μl de mediu proaspăt. Celulele au fost incubate timp de alte 22 de ore, urmate de adăugarea soluției MTT în PBS, fără ionii de magneziu și calciu. Concentrațiile de MTT din culturile testate au fost 330 μg /mL. După 2,5 ore de incubație, MTT a fost îndepărtat. Celulelor li s-a adăugat 100μl DMSO (POCH, Polonia) și au fost amestecate pentru dizolvarea cristalelor de formazan. După dizolvarea cristalelor, absorbția formazanului a fost măsurată cu spectrometrul SPECTROStar Nano (BMG Labtech, SUA).
 
2.10 Studii referitoare la biodisponibilitate formulelor de vitamina C lipozomale și libere
Obiectivul studiului a fost de a compara profilurile concentrației serice de vitamina C la voluntarii sănătoși, ulterior administrării unei doze orale unice, fie sub forma suspensiei lipozomale, fie sub forma unei soluții apoase. După obținerea acordului scris, 20 de voluntari sănătoși (10 femei și 10 bărbați, cu vârsta între 31 și 65 de ani) au fost incluși în studiu. Voluntarii sub 18 ani, femeile însărcinate, persoanele cu insuficiență renală și tulburări de tract gastrointestinal au fost excluși din studiu. Voluntarii au fost pregătiți prin impunerea unui post timp de 12 ore anterioare testului. Fiecărui participant i s-a montat un cateter venos periferic care a permis recoltarea mai multor eșantioane de sânge, în timpul desfășurării studiului. Anterior studiului principal, au fost recoltate eșantioane de sânge pentru a determina concentrația inițială de vitamina C. Fiecărui participant i s-au administrat 10 grame de vitamina C, fie sub formă liberă, fie sub formă lipozomală, într-o singură doză, dizolvate / suspensie, în 250ml apă. Urmând administrării vitaminei C, au fost recoltate eșantioane de sânge la 30 minute, 60 minute, 90 minute, 120 minute, 180 minute, 240 minute și 360 minute. De fiecare dată, 4 mL de sânge au fost transferați în eprubete cu heparină, ca anticoagulant, în conformitate cu recomandările emise de Karlsen et al (Karlsen, Blomhoff and Gundersen, 2005). 
Concentrațiile de vitamina C din eșantioanele de sânge au fost determinate în termen de 48 de ore după recoltate, prin utilizarea unui dispozitiv HPLC dotat cu detector UV/VIS. Eșantioanele de sânge au fost depozitate la o temperatură de 4°C anterior analizării. Au fost efectuate studii de către Centrul de Cercetări și Dezvoltare la Spitalul Specializat din Wrocław.
 
2.11 Determinarea concentrațiilor de vitamina C din eșantioanele de sânge 
Determinarea concentrațiilor de vitamina C din eșantioanele de sânge a fost efectuată pe baza metodei descrise de Karlsen et al (Karlsen, Blomhoff and Gundersen, 2005). În mod specific, eșantioanele de sânge au fost centrifugate la 15.000 rpm timp de 5 minute. Au fost extrași 500 μl de ser și amestecați cu o soluție 10% TCA într-un raport 1: 1, urmată de centrifugare pentru a îndepărtare proteinele precipitate.
Ulterior, supernatantul a fost trecut printr-un filtru seringă cu un diametru al porilor de 220 nm.
Soluțiile rezultate au fost analizate pentru a identifica conținutul de vitamina C. Curbele de calibrare au fost generate individual pentru fiecare pacient, prin adăugarea cantităților predeterminate de soluție de ascorbat de sodiu la 1 ml de sânge integral, urmată de tratamentul aplicat eșantionului, așa cum este descris mai sus. Rata de recuperare a fost determinată într-un experiment separat, prin utilizarea eșantioanele pregătite prin adăugarea unei cantități cunoscute de vitamina C la plasmă, utilizând procedura descrisă mai sus. Au fost calculați următorii parametri din datele brute: AUC, Tmax, Cmax și T1/2 utilizând programul de analizare date Qtiplot.
 
2.12 Analiza statistică
Datele sunt exprimate sub forma deviației standard medii (S.D.). Diferențele dintre grupurile de celule, în cadrul testelor de toxicitate, au fost analizate cu ajutorul ANOVA unifactorial, datele referitoare la biodisponibilitate au fost analizate cu testul T independent. A fost considerată semnificativă o valoare de p < 0,05. Pentru analiza statistică, a fost utilizat programul Qtiplot.
 
2.13 Acorduri etice pentru desfășurarea studiului 
Toate procedurile care implică subiecți umani / pacienți au fost aprobate de Comisia de Bioetică. Acordul informat scris  a fost obținute de la toți subiecții. Vitamina C lipozomală, clasificată ca supliment alimentar, a fost produsă în conformitate cu condițiile care îndeplinesc cerințele HACCP, pe baza Reglementării Parlamentului European Nr. 852/2004 din 29.04.2004 (Jurnalul Legilor UE din 2004, așa cum a fost amendat) și Legea Nutriției și Siguranței Alimentare din 25.08.2006 (Jurnalul Legilor UE din 2015, articolul 594).
 
Va urma ....

Lasa un comentariu